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HL-SAN熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶

發(fā)布時(shí)間: 2023-11-01  點(diǎn)擊次數(shù): 488次

 


ArcticZymes Technologies成立于20世紀(jì)80年代后期,總部位于挪威北部的特羅姆瑟(Troms?)。立足北極海洋區(qū),致力于從海洋生物中識(shí)別新的冷適應(yīng)酶,用于分子研究、體外診斷和治療領(lǐng)域。ArcticZymes專注于與全球的合作伙伴和商業(yè)創(chuàng)新者建立牢固可靠的關(guān)系。因此,我們一直在探索并開發(fā)更加不一樣的產(chǎn)品,不斷滿足并且超過合作伙伴的期望。

HL-SAN熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶70910-202 

描述

無論是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模樣品制備、還是生產(chǎn)規(guī)模工藝過程,去除核酸都可以改善工藝流程,如蛋白純化、病毒載體制備、mNGS中樣品處理等過程。而核酸酶的選擇,就顯得特別重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶,HL-SAN) 是一種非特異性內(nèi)切酶,在高鹽濃度下具有較佳活性;且該酶在多種緩沖液中都有活性,很容易通過還原劑處理而失活。這些特性使HL-SAN在需要去除DNARNA的應(yīng)用中,更為適合。

核酸污染,特別是宿主基因組DNA污染,在幾乎所有工藝流程及生物制品的生產(chǎn)中,都是需要重點(diǎn)解決的問題。一方面,宿主DNA的存在,影響目標(biāo)產(chǎn)物的純化及下游質(zhì)量分析等。另一方面,宿主DNA殘留能引起機(jī)體嚴(yán)重的免疫反應(yīng),是生物制品的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)之一,FDANMPA等對(duì)Host Cell DNA (HCD)有嚴(yán)格的質(zhì)控要求。

宿主基因組DNA中,組蛋白與DNA形成核小體,核小體緊密折疊形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的染色質(zhì)。組蛋白與DNA間存在強(qiáng)烈的離子作用及疏水作用,再加上特殊的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致宿主DNA很難被準(zhǔn)確檢測(cè)并清除。已有文獻(xiàn)表明,高鹽濃度下組蛋白與DNA解離相對(duì)很好,這有利于宿主DNA的檢測(cè)及去除。但市售的絕大多數(shù)核酸酶在高鹽濃度下活性很弱,甚至全部失活。而耐高鹽的HL-SAN成了這類應(yīng)用的理想選擇。

高鹽濃度能夠提高去除效率

HL-SAN是一種新型的、耐高鹽的工程化內(nèi)切酶。該酶在0.5 M NaCl條件下具有較佳活性,是去除宿主DNA污染的理想選擇。

鹽濃度是去除過程的重要參數(shù)之一。高鹽濃度下,宿主DNA與蛋白質(zhì)能夠全部解離,從而更容易被降解。

推薦應(yīng)用

1. 病原微生物診斷應(yīng)用,如宏基因組測(cè)序(mNGS)樣品去除宿主DNA

2. 蛋白純化,特別是DNA結(jié)合蛋白;

3. 病毒載體制備,如腺相關(guān)病毒(AAV)、腺病毒(AdV)等;

4. 其他需要去除宿主DNA的應(yīng)用等。

優(yōu)勢(shì)

1. 鹽條件下,DNA清除效率更高,宿主DNA殘留更少;

2. pI9.6,容易跟絕大多數(shù)蛋白分離;

3. 還原劑存在時(shí),酶易失活,減少對(duì)后續(xù)流程的影響。

4.溫度穩(wěn)定

5.在低溫下活躍(6℃時(shí)為20%

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù):

img1 

img2 

Figure 1. HL-SAN的特性

使用指導(dǎo)

1. DNA去除方案

從細(xì)胞抽提物或細(xì)胞裂解液中去除DNA污染,HL-SAN的使用量受到多種因素影響,如細(xì)胞類型、裂解液組成、NaCl濃度、Mg2+濃度、裂解液pH等。參考方案見Figure 1。比如,對(duì)于1ml細(xì)胞裂解樣品,調(diào)整到0.3-0.75 M NaCl濃度,加入1000 U HL-SAN,15-37溫度條件下孵育30-60min,或者4過夜。Mg2+是必須的。

img3 

Figure 2. 不同樣品、不同去除要求下,HL-SAN的推薦濃度及反應(yīng)條件。(DNA removal的要求是指通過瓊脂糖凝膠電泳看不到條帶。Decontamination的去除要求是對(duì)23S rDNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)為陰性。)

2. 滅活

滅活是通過添加還原劑(TCEPDTT)來實(shí)現(xiàn)的,推薦用TCEP(因?yàn)?/span>TCEP在磷酸鹽溶液中不穩(wěn)定,特別在中性pH下)。不同工藝流程中,通過改變孵育時(shí)間、溫度和還原劑的濃度等來活該酶。一般情況下, 25-37反應(yīng)5-10分鐘,可以滅活99%以上的酶。為了避免酶恢復(fù)活性、再次激活,保持低濃度還原劑,如0.1-0.5 mM DTTTCEP,或延長(zhǎng)滅活反應(yīng)時(shí)間。

3. 去除

HL-SANpI9.6,能夠緊密結(jié)合陽離子交換柱。在pH 9.0條件下用0.2M鹽沖洗,柱子的流出液/廢液中只有不到0.02%酶脫落。需要注意的是,不推薦使用陰離子交換柱去除HL-SAN,因?yàn)?/span>HL-SAN的糖基化修飾會(huì)結(jié)合到柱子上。

img4 

Figure 3. HL-SAN緊密結(jié)合在SP-sepharose柱子上(體系是0.2 M鹽濃度,pH 9.0)。

應(yīng)用實(shí)例:

高效去除人體DNA (99.99%)干擾、快速檢測(cè)下呼吸道感染(LRIs)病原

呼吸道感染(RIs)病原的快速檢測(cè)一直是醫(yī)療中亟待解決的問題。RIs樣本類型眾多并且病原含量差別很大,同時(shí)帶有大量的人體細(xì)胞,因此搭建一套快速、高效的樣本處理系統(tǒng)對(duì)于通過高通量測(cè)序進(jìn)行病原檢測(cè)至關(guān)重要。

2019Nature Biotechnology文章報(bào)道了如下流程。為了盡可能去除宿主DNA、提高檢測(cè)靈敏度,在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的人體宿主細(xì)胞去除、微生物DNA提取和nanopore測(cè)序等三個(gè)步驟都做了對(duì)應(yīng)的優(yōu)化,比如宿主DNA去除時(shí)找到了合適濃度的saponin2.2%),HL-SAN步驟由兩步減為一步,清洗步驟縮減為2次。從拿到樣本到建庫完成縮短至6hr,且在較終檢測(cè)中達(dá)到了96.6%的敏感性和100%的特異性。img5

Figure4. Nanopore宏基因組快檢流程。

熱銷產(chǎn)品

貨號(hào)

品名

規(guī)格

70910-202

HL-SAN

25000U

70921-202

SAN HQ Triton FREE

25kU

70921-150

SAN HQ Triton FREE >250-500kU

500000units

70800-201

HL-dsDNase2-250

250U

70800-202

HL-dsDNase 2-1000

1000units

70500-201

Cod Uracil-DNA Glycosylase Cod UNG-1-100

100units

71600-201

ArcticZymes Proteinase

50units

71502-201

IoPol BST+ 5-200

200units

71502-001

IsoPol BST+ 10X Reaction Buffer Pack

1units

北京和生物科技有限公司專業(yè)代理arctizymes全系列產(chǎn)品,專營進(jìn)口生物試劑,科學(xué)儀器,實(shí)驗(yàn)消耗品,化工原料及藥物中間體等。公司與諸多國外品牌簽下代理,sigma、santa、RD、AbcamCST、toxin、streck、Biolegend、ebioscience、saracarepolyplus、Beyotime、Novus、moltox等,能為廣大科研用戶提供數(shù)萬種試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)消耗品。

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